大孔吸附树脂法富集菟丝子总黄酮的实验研究
摘要：目的：研究大孔吸附树脂富集菟丝子总黄酮的工艺条件及参数。方法：以静态饱和吸附量、动态吸附洗脱率为考察指标，比较了6种大孔树脂纯化菟丝子总黄酮的工艺。又以总黄酮和金丝桃苷含量为指标。对最佳树脂吸附工艺条件进行了筛选。结果：6种树脂中，HPD-100型树脂具有良好的吸附，可使提取物中总黄酮的含量达到30.31%。结论：HPD-100型树脂可用作菟丝子总黄酮的分离纯化。
关键词：菟丝子；金丝桃苷；大孔吸附树脂
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1964-02
中药菟丝子为临床常用中药，始载于《神农本草经》，列为上品。具有补肝肾、益精明目、安胎等功效，是中医补肾、壮阳、固精之要药。菟丝子类生药含有黄酮、多糖和甾醇等成分，其中黄酮类成分为主要的有效化学成分，如金丝桃苷、槲皮索、山奈酚等，并且金丝桃苷含量较大。本文以菟丝子中的主要成分金丝桃苷和总黄酮含量为指标，初步考察了采用大孔吸附树脂富集菟丝子总黄酮的工艺。
, http://www.100md.com
1 仪器与材料
1.1 仪 器
LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，4孔恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)，721型分光光度计(上海分析仪器厂)、电子天平MetflerAE240。
1.2 材 料
AB-8型、HPD-100型、HPD-600型、HPD-450型大孔吸附树脂购于沧州宝恩化工有限公司，D-101型、NKA-9型大孔吸附树脂购于南开大学化工厂；金丝桃苷对照品购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，乙醇为药用乙醇。菟丝子药材购于2006年5月份采自内蒙古地区。
2 方法与结果
2.1 样品含量测定方法
, 百拇医药
2.1.1 金丝桃苷的含量测定 取菟丝子提取液干燥至恒重的药粉1g，精密称定，用乙醇超声溶解并定容至25mL，作为未上柱前的供试品溶液。另取上柱后菟丝子提取液经干燥至恒重的药粉0.2g，精密称定，用乙醇超声溶解并定容至25mL，作为上柱后的供试品溶液。再取金丝桃苷标准品适量，精密称定，加乙醇使成1mL含0.1mg溶液，作为对照品溶液。采用高效液相色谱法进行测定。色谱柱：十八烷基键合硅胶(150mm ×4.6mm)；流动相为甲醇-0.025mol/L水(40:60)；检测波长：370nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min；进样量：3μL。
2.1.2 总黄酮的含量测定 精密称取干燥至恒重的芦丁标准品25mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，精密吸取20mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀即得0.2mg/mL芦丁标准品溶液。精密吸取上述标准品溶液1、2、3、4、5、6mL分别置于25 mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液10mL，用蒸馏水定容至25mL，放置15min，以相应试剂为空白，在波长500nm处测定吸光度，以浓度C对吸光度A作标准曲线，得回归方程C＝81.40A-2.7459，r＝0.9996在浓度范围0.128-0.578mg/mL之间吸光度与浓度呈线形关系。取一定量的待测液于25mL量瓶中，按“加水至6mL”起依法操作，测定其在500nm处吸光度A。由标准曲线或回归方程计算出黄酮含量。
, http://www.100md.com
2.2 树脂的筛选
2.2.1 上柱液的制备 称取菟丝子药材粗粉200g，加8倍量95%的乙醇，回流4h，然后过滤，浓缩，并另器保存备用。
2.2.2 静态吸附实验 每种树脂0.4g，精密称定，分别加入10mL药液(金丝桃苷的浓度4.429mg/mL)，摇匀，于冰箱中放置3天，充分吸附后，利用高效液相色谱测定吸附前和吸附后溶液中的金丝桃苷含量，计算其差值，便得树脂吸附容量。吸附容量＝(吸附前金丝桃苷总量-吸附后金丝桃苷总量)/树脂称量。
2.2.3 动态吸附实验 取以上6种树脂，用乙醇浸泡24h，充分溶胀装柱(D13mm×H70mm)，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇味，每个树脂上样6mL(浓度4.429mg/mL)，先用相同体积的水洗脱至无色，再用30%乙醇洗脱，薄层检查，洗脱液有金丝桃苷斑点时开始接取，至洗脱液无金丝桃苷斑点时停止接取，并将该洗脱液定容至500mL量瓶中，采用高效液相色谱法测定每份洗脱液中金丝桃苷的含量，结果见表2。洗脱率＝洗脱液中金丝桃苷总量/上样药液中金丝桃苷总量。
, 百拇医药
结果显示：HPD-100型大孔吸附树脂无论是吸附容量，还是洗脱率，都明显优于其他型号的大孔吸附树脂，故确定分离、纯化菟丝子所用的树脂型号为HPD-100型大孔吸附树脂。
2.3 HPD-100型树脂吸附菟丝子总黄酮工艺优化
2.3.1 洗脱溶媒浓度对总黄酮收率及纯度影响 取已经过预处理的大孔吸附树脂装3根柱(D13mm×H70mm)，每根柱上样6mL(金丝桃苷的浓度4.429mg/mL)，先用相同体积的水洗脱至无色，再分别用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇洗脱接取薄层检查有金丝桃苷斑点部分的洗脱液，并将洗脱液定容至500mL量瓶中，分别采用高效液相色谱法和紫外分光光度法(见“样品含量测定方法”)测定每种洗脱液中金丝桃苷的含量和总黄酮的含量。另每份洗脱液精密吸取100mL置蒸发皿中，水浴蒸干，再置烘箱中60℃干燥至恒重，计算于膏量及干膏中金丝桃苷和总黄酮的百分含量。结果显示，30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇都可将总黄酮类成分从大孔吸附树脂上洗脱下来，但50%乙醇和70%乙醇同时也洗脱下其他成分，导致出膏量过大，需进一步纯化，造成工艺复杂，故确定洗脱溶剂为30%乙醇。
, 百拇医药
2.3.2 泄漏曲线的考察 泄漏曲线主要是考察树脂动态吸附的最大上样量，取已处理好的大孔吸附树脂装柱(D13mm×H70mm，体积约10mL)，在树脂柱顶端不断加入药液，药液通过树脂柱，每5mL收集1份，药液用微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法测定金丝桃苷的含量，绘制泄漏曲线。共收集了20份。结果显示，第8个流份金丝桃苷的峰面积明显变大，说明从第8份开始，金丝桃苷开始泄漏，即当药液量达到40mL时，树脂达到最大吸附，每毫升药液含生药0.08g，因此每毫升树脂在动态情况下最多可吸附0.32g生药。
2.3.3 洗脱剂用量的考察 取已经过预处理的大孔吸附树脂装柱(D13mm×H65mm，体积8.6mL)，上样20mL(每毫升药液相当于0.08g生药)，先用水洗脱至无色，再用30%乙醇进行洗脱，每5mL收集1份，共收集20份，采用高效液相色谱法测定每一份洗脱液中金丝桃苷的峰面积，绘制洗脱曲线，计算累计峰面积及累计百分含量。结果显示，洗脱至第10流份(收集洗脱液50mL)时，已洗脱下近95%，继续洗脱，每份中金丝桃苷的含量都很少，且回收溶剂将增加生产成本，故初步定为用30%乙醇50mL(即5个柱体积)洗脱。
, http://www.100md.com
2.3.4 水洗脱用量的确定 药液上柱后用水进行洗脱，洗脱3个柱体积后，洗脱液颜色明显变淡，继续洗脱对试验结果影响不大，故确定用水洗脱3个柱体积即可。
2.3.5 富集程度考察 取50mL菟丝子提取液，按上述条件上柱洗脱，收集水洗脱液浓缩干燥至恒重，收集30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，并减压干燥至恒重。另取50mL菟丝子提取液亦减压干燥至恒重，分别测定总黄酮的含量。
以HPD-100型大孔吸附树脂柱前后的总黄酮为指标，大孔吸附树脂法可以有效的去除杂质，使总黄酮的含量大幅度提高，而且总黄酮的洗脱率为89.68%，说明HPD-100型大孔吸附树脂可用于菟丝子中总黄酮的富集。
3 讨 论
影响树脂吸附性能的因素很多，其吸附性能的优劣由其化学和物理结构所决定，树脂的极性和空间结构(孔径、比表面积、孔容)是影响吸附性能的重要因素。树脂吸附作用的根本因素是吸附剂与吸附质之间的作用力，即范德华力。本实验所用的树脂是苯乙烯型，有中极性、弱极性、非极性3种类型，从吸附量试验可以看出，吸附量大的多为非极性树脂。
并且，大孔吸附树脂具有机械强度好、选择性好、吸附量高、解析容易、可反复使用、耐污染强等特点。实验证明大孔吸附树脂纯化菟丝子总黄酮的方法是可行的，为菟丝子总黄酮在医药及食品方面的进一步应用奠定了科学的基础。, 百拇医药(王 刚 杨松松 曹 阳)
关键词：菟丝子；金丝桃苷；大孔吸附树脂
中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)09-1964-02
中药菟丝子为临床常用中药，始载于《神农本草经》，列为上品。具有补肝肾、益精明目、安胎等功效，是中医补肾、壮阳、固精之要药。菟丝子类生药含有黄酮、多糖和甾醇等成分，其中黄酮类成分为主要的有效化学成分，如金丝桃苷、槲皮索、山奈酚等，并且金丝桃苷含量较大。本文以菟丝子中的主要成分金丝桃苷和总黄酮含量为指标，初步考察了采用大孔吸附树脂富集菟丝子总黄酮的工艺。
, http://www.100md.com
1 仪器与材料
1.1 仪 器
LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，4孔恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)，721型分光光度计(上海分析仪器厂)、电子天平MetflerAE240。
1.2 材 料
AB-8型、HPD-100型、HPD-600型、HPD-450型大孔吸附树脂购于沧州宝恩化工有限公司，D-101型、NKA-9型大孔吸附树脂购于南开大学化工厂；金丝桃苷对照品购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，乙醇为药用乙醇。菟丝子药材购于2006年5月份采自内蒙古地区。
2 方法与结果
2.1 样品含量测定方法
, 百拇医药
2.1.1 金丝桃苷的含量测定 取菟丝子提取液干燥至恒重的药粉1g，精密称定，用乙醇超声溶解并定容至25mL，作为未上柱前的供试品溶液。另取上柱后菟丝子提取液经干燥至恒重的药粉0.2g，精密称定，用乙醇超声溶解并定容至25mL，作为上柱后的供试品溶液。再取金丝桃苷标准品适量，精密称定，加乙醇使成1mL含0.1mg溶液，作为对照品溶液。采用高效液相色谱法进行测定。色谱柱：十八烷基键合硅胶(150mm ×4.6mm)；流动相为甲醇-0.025mol/L水(40:60)；检测波长：370nm；柱温：40℃；流速：0.8mL/min；进样量：3μL。
2.1.2 总黄酮的含量测定 精密称取干燥至恒重的芦丁标准品25mg于50mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，摇匀，精密吸取20mL于50mL容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀即得0.2mg/mL芦丁标准品溶液。精密吸取上述标准品溶液1、2、3、4、5、6mL分别置于25 mL容量瓶中，各加水至6mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，静置6min，加10%硝酸铝溶液1mL，摇匀，放置6min，加入1.0mol/L氢氧化钠溶液10mL，用蒸馏水定容至25mL，放置15min，以相应试剂为空白，在波长500nm处测定吸光度，以浓度C对吸光度A作标准曲线，得回归方程C＝81.40A-2.7459，r＝0.9996在浓度范围0.128-0.578mg/mL之间吸光度与浓度呈线形关系。取一定量的待测液于25mL量瓶中，按“加水至6mL”起依法操作，测定其在500nm处吸光度A。由标准曲线或回归方程计算出黄酮含量。
, http://www.100md.com
2.2 树脂的筛选
2.2.1 上柱液的制备 称取菟丝子药材粗粉200g，加8倍量95%的乙醇，回流4h，然后过滤，浓缩，并另器保存备用。
2.2.2 静态吸附实验 每种树脂0.4g，精密称定，分别加入10mL药液(金丝桃苷的浓度4.429mg/mL)，摇匀，于冰箱中放置3天，充分吸附后，利用高效液相色谱测定吸附前和吸附后溶液中的金丝桃苷含量，计算其差值，便得树脂吸附容量。吸附容量＝(吸附前金丝桃苷总量-吸附后金丝桃苷总量)/树脂称量。
2.2.3 动态吸附实验 取以上6种树脂，用乙醇浸泡24h，充分溶胀装柱(D13mm×H70mm)，用乙醇洗至洗出液加适量水无白色浑浊现象，再用蒸馏水洗至无醇味，每个树脂上样6mL(浓度4.429mg/mL)，先用相同体积的水洗脱至无色，再用30%乙醇洗脱，薄层检查，洗脱液有金丝桃苷斑点时开始接取，至洗脱液无金丝桃苷斑点时停止接取，并将该洗脱液定容至500mL量瓶中，采用高效液相色谱法测定每份洗脱液中金丝桃苷的含量，结果见表2。洗脱率＝洗脱液中金丝桃苷总量/上样药液中金丝桃苷总量。
, 百拇医药
结果显示：HPD-100型大孔吸附树脂无论是吸附容量，还是洗脱率，都明显优于其他型号的大孔吸附树脂，故确定分离、纯化菟丝子所用的树脂型号为HPD-100型大孔吸附树脂。
2.3 HPD-100型树脂吸附菟丝子总黄酮工艺优化
2.3.1 洗脱溶媒浓度对总黄酮收率及纯度影响 取已经过预处理的大孔吸附树脂装3根柱(D13mm×H70mm)，每根柱上样6mL(金丝桃苷的浓度4.429mg/mL)，先用相同体积的水洗脱至无色，再分别用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇洗脱接取薄层检查有金丝桃苷斑点部分的洗脱液，并将洗脱液定容至500mL量瓶中，分别采用高效液相色谱法和紫外分光光度法(见“样品含量测定方法”)测定每种洗脱液中金丝桃苷的含量和总黄酮的含量。另每份洗脱液精密吸取100mL置蒸发皿中，水浴蒸干，再置烘箱中60℃干燥至恒重，计算于膏量及干膏中金丝桃苷和总黄酮的百分含量。结果显示，30%乙醇、50%乙醇和70%乙醇都可将总黄酮类成分从大孔吸附树脂上洗脱下来，但50%乙醇和70%乙醇同时也洗脱下其他成分，导致出膏量过大，需进一步纯化，造成工艺复杂，故确定洗脱溶剂为30%乙醇。
, 百拇医药
2.3.2 泄漏曲线的考察 泄漏曲线主要是考察树脂动态吸附的最大上样量，取已处理好的大孔吸附树脂装柱(D13mm×H70mm，体积约10mL)，在树脂柱顶端不断加入药液，药液通过树脂柱，每5mL收集1份，药液用微孔滤膜过滤，用高效液相色谱法测定金丝桃苷的含量，绘制泄漏曲线。共收集了20份。结果显示，第8个流份金丝桃苷的峰面积明显变大，说明从第8份开始，金丝桃苷开始泄漏，即当药液量达到40mL时，树脂达到最大吸附，每毫升药液含生药0.08g，因此每毫升树脂在动态情况下最多可吸附0.32g生药。
2.3.3 洗脱剂用量的考察 取已经过预处理的大孔吸附树脂装柱(D13mm×H65mm，体积8.6mL)，上样20mL(每毫升药液相当于0.08g生药)，先用水洗脱至无色，再用30%乙醇进行洗脱，每5mL收集1份，共收集20份，采用高效液相色谱法测定每一份洗脱液中金丝桃苷的峰面积，绘制洗脱曲线，计算累计峰面积及累计百分含量。结果显示，洗脱至第10流份(收集洗脱液50mL)时，已洗脱下近95%，继续洗脱，每份中金丝桃苷的含量都很少，且回收溶剂将增加生产成本，故初步定为用30%乙醇50mL(即5个柱体积)洗脱。
, http://www.100md.com
2.3.4 水洗脱用量的确定 药液上柱后用水进行洗脱，洗脱3个柱体积后，洗脱液颜色明显变淡，继续洗脱对试验结果影响不大，故确定用水洗脱3个柱体积即可。
2.3.5 富集程度考察 取50mL菟丝子提取液，按上述条件上柱洗脱，收集水洗脱液浓缩干燥至恒重，收集30%乙醇洗脱液，减压回收乙醇，并减压干燥至恒重。另取50mL菟丝子提取液亦减压干燥至恒重，分别测定总黄酮的含量。
以HPD-100型大孔吸附树脂柱前后的总黄酮为指标，大孔吸附树脂法可以有效的去除杂质，使总黄酮的含量大幅度提高，而且总黄酮的洗脱率为89.68%，说明HPD-100型大孔吸附树脂可用于菟丝子中总黄酮的富集。
3 讨 论
影响树脂吸附性能的因素很多，其吸附性能的优劣由其化学和物理结构所决定，树脂的极性和空间结构(孔径、比表面积、孔容)是影响吸附性能的重要因素。树脂吸附作用的根本因素是吸附剂与吸附质之间的作用力，即范德华力。本实验所用的树脂是苯乙烯型，有中极性、弱极性、非极性3种类型，从吸附量试验可以看出，吸附量大的多为非极性树脂。
并且，大孔吸附树脂具有机械强度好、选择性好、吸附量高、解析容易、可反复使用、耐污染强等特点。实验证明大孔吸附树脂纯化菟丝子总黄酮的方法是可行的，为菟丝子总黄酮在医药及食品方面的进一步应用奠定了科学的基础。, 百拇医药(王 刚 杨松松 曹 阳)
参见：首页 > 中医药 > 中药专业 > 中草药汇编 > 中药大典 > 种子类 > 菟丝子